使用封闭式、伽马辐照、一次性使用TFF平板膜包进行AAV研究
使用封闭式、伽马辐照、一次性使用TFF平板膜包进行AAV研究
David Bianchi, Carl Breuning, Michael LaBreck,Shelly Parra, Mary Jo Wojtusik, Repligen Corporation
Alex Meola, Michael Mercaldi, Thomas Thiers, Homology, Medicines Inc.
摘要
封闭式系统可降低生物负荷敏感型工艺的风险，并有助于提高设施资源的灵活性。研究在腺相关病毒(AAV)载体浓缩应用中，比较了封闭式、伽马辐照切向流过滤(TFF)过滤装置与类似的开放、未辐照切向流过滤装置的性能。结果显示，工艺时间、通量、跨膜压力(TMP)和回收率相当，这可方便工艺开发在一次性使用TFF膜包中快速地执行，并便于连接至封闭的一次性使用TFF设备。
简介
病毒载体是目前最强大的体内基因治疗传递系统之一，临床应用数量在不断增加。而这反过来又推动了对病毒载体的生产需求，如腺相关病毒、慢病毒和腺病毒。在广泛的可用载体库中，AAV由于其安全性、低免疫原性和长期转基因表达的特点，是最常被选择的载体之一。
图1.包括两步TFF步骤的AAV生产工艺
AAV的下游工艺包括(图1)一系列纯化技术的使用，旨在生产高纯度且浓缩的最终药物产品。其中一种技术是用于超滤/洗滤的TFF。超滤/洗滤的关键执行指标包括时间、收率、成本、设备兼容性以及内毒素水平。常见的TFF系统的部件通常包括多个容器、TFF膜包、两个泵以及多个流量计。将部件整合到系统中大约需要20个连接，每个连接点都是污染风险点。该技术通常需要在时间、成本、污染、设备利用率和产量方面进行可能的工艺优化。以在整个生产过程中使用两个TFF单元操作为例，TFF工艺优化的好处可成倍增加。
一次性使用TFF过滤器的引入，如TangenX® SIUS®膜包，将典型TFF操作从大约需要12个小时的10个步骤减少到3个步骤，从而极大地节省了单元操作时间。一次性使用TFF过滤器还可以潜在地减少50%的缓冲液消耗，既节省其制备时间，又降低了物料和废液处理的成本。现在，一次性使用SIUS®膜包又被改造成封闭式、伽马辐照的系统，即TangenX® SIUS®Gamma装置(图2)，其包括过滤器、歧管、卡箍、管路以及AseptiQuik®接头(表1)。使用SIUS® Gamma装置，搭建时间和复杂性均可适度降低，但最重要的是，封闭式系统在降低产品、环境和操作员风险方面的天然优势，而在快节奏的行业中，安全性和质量至关重要。
图2. TangenX® SIUS® 膜包和SIUS® Gamma 装置
表1. TangenX® SIUS® Gamma装置将一次性使用工艺效率构建至封闭式、辐照的形式中
封闭式系统的构建和物流可能受到专利接头和供应商限制的挑战。在三个端口分别使用不分公母的AseptiQuik®接头进行管路端封，使操作者可以有多种连接选择，将现有的更小、更模块化的流路或管路装置集成在一起。
本案例研究介绍使用SIUS® Gamma装置对源于人类造血干细胞的澄清AAV载体样品 (AAV- HSCs)进行浓缩和洗滤的工艺优化和规模放大。AAV-HSCs是由Homology Medicines, Inc.开发的具有独特特性的腺相关病毒载体专利平台。AAV-HSCs在体内的递送通过基因治疗或患者DNA修复过程(一种自然的、无核酸酶的基因编辑机制)精确而有效地进行。本研究的主要目标是在实验室环境中使用并证实辐照的SIUS® Gamma 装置与未辐照的SIUS®膜包在AAV-HSCs浓缩和洗滤步骤中的等效性。
材料和方法
TangenX® SIUS® 膜包和SIUS® Gamma装置的安装均按制造商的说明进行。安装SIUS®膜包后，系统管路、导流板和接头用0.2 N NaOH消毒。SIUS®膜包已使用0.2 N NaOH预消毒并包装，因此不需要消毒，但组装的管路、导流板和流路仍需要消毒。SIUS® Gamma装置只需安装在不锈钢夹具上，用AseptiQuik®接头连接到预消毒的流路上，并用缓冲液冲洗即可。
工艺开发膜和配置筛选
优化和规模放大前，通过筛选实验确定用于澄清AAV-HSC浓缩的最合适截留分子量(MWCO) HyStream膜。使用Repligen KrosFlo® KR2i TFF 系统，结合0.01 m2膜包，将1 L料液浓缩20倍，至0.05 L。在浓缩1、5、10、15和20倍时，分别从产品池中取回流样品，以做进一步分析。
同时使用0.01 m2 300kD L筛网(产品编号 XP300LP1L)和开放流道(产品编号 XP300LP1J) 膜包进行实验，以确定其对于该工艺的适用性。
优化和规模放大
优化研究使用TangenX® LHV系统、100 mL 滴度约为10^9 vg/mL的澄清AAV-HSC进样料液以及0.01 m2、100 kD L-筛网 HyStream SIUS® 膜包进行。在3、5和7 LPM/m2错流流速条件下，进行通量测试。
以0.01 m2、 100 kD的L-筛网膜包 (产品编号 XP100LP1L)在优化的操作条件下进行构型实验，实验使用恒定的跨膜压 (TMP) 15 psi，不进行滤液流速控制，错流流速为7 LPM/m2。
10倍规模放大步骤和洗滤实验使用KrosFlo® KR2i TFF系统、10 L滴度约为10^9 vg/mL的澄清AAV-HSC料液以及 0.1 m2 、100 kD L- 筛网HyStream 膜包 (产品编号 XP100L01L) 进行了20 倍浓缩。最终的0.5 L料液以恒体积洗滤模式进行了10体积洗滤。
规模放大方案
基于10 L 工艺获得的数据，对50 L和200 L规模浓缩10倍的操作参数进行了计算 (表2)。要求的工艺时间设定为约2小时，在计算中，时间作为一个常数输入。10 L的实验中，在洗滤期间及结束时，在多个时间点对进样物料的正常流速可滤性进行了评估 (数据未显示)。洗滤不会提高浓缩的AAV-HSC产品的0.2 μm可滤性。由于在10L规模下，洗滤没有显示出工艺优化，规模扩大的方案仅限于浓缩。
表2. 规模放大方案
如50 L 料液在2 小时内浓缩10倍，不进行洗滤，需要4块0.1 m2 100 kD L-筛网 SIUS® 膜包，载量为125 L/m2。同样，200 L料液浓缩10倍，不进行洗滤，需要单块1.5 m2 SIUS® 膜包，载量为133 L/m2。
使用100 kD 0.5 m2 HyStream膜包 (产品编号 XP100G05L)和100 kD 0.5 m2 SIUS® Gamma装置(HyStream膜、100 kD、0.5 m2) (产品编号 XP100L05L)，对澄清AAV-HSC收获液同等分批的实验证实了非辐照和伽马辐照TFF产品具有相当的性能。
使用正交分析方法测量了基于SIUS®膜包和SIUS® Gamma装置的工艺之间的收率相当性。数字液滴PCR (ddPCR) 用于定量检测病毒基因组靶标。ELISA用于使用蛋白靶标定量检测病毒衣壳。
结果
膜和配置筛选
HyStream 100 kD L-筛网膜包在无偏差运行中的平均通量为49.5 LMH (L/m2/hr)。HyStream 300 kd L-筛网膜包的平均通量为50 LMH，但在运行接近结束时出现污染迹象。由于明显的污染和极化，且无法找到稳定的操作条件，开放 (J) 流道的HyStream 300 kD膜包需要经常调节错流流速和滤液通量。基于这些结果，HyStream 100 kD SIUS® 膜包选择用于AAV-HSC浓缩/洗滤工艺。20倍浓缩时，收率为85%，滤液中无产物透过。
通过测试实验优化通量
通量测试实验使用100 kD膜进行，以确定滤液通量最高且不会造成膜过度极化或污染的最佳TMP (图3)。结果显示，以15 - 20 psi TMP和错流流速 (CFF) 7.0 LPM/ m2操作为最佳条件，可获得100 - 120 LMH的初始滤液通量。
图3.通量测试曲线确定最佳TMP和CFF条件
浓缩和洗滤规模放大
在1 L确认实验基础上，进行了10倍规模放大，将10 L AAV-HSC起始料液浓缩20倍至 0.5 L，然后进行10 DV等体积缓冲液置换。在从1.0 x 10^10 vg /mL到2.0 x 10^11 vg / mL的20倍浓缩过程中，起始通量约为90 LMH，然后在浓缩接近10 - 20倍时，下降到40 LMH (图4)。预期的通量下降趋势源于浓缩的增加而导致的粘度和/或浓差极化层密度的提高。根据趋势线延伸的通量与浓度图得出了凝胶层常数CG的理论值。CG可用于计算开始进行洗滤缓冲液置换时的浓度(CDV)，从而平衡工艺时间和消耗的缓冲液体积。
CDV=CG/e
=CG/2.72
图4. 使用0.1 m2 TangenX® SIUS®膜包进行10 L 至 0.5 L的20 倍浓缩期间的浓度 vs 通量图。
利用从通量与浓度因子增长图中推断的趋势线，CDV被确定为显著大于100X，表明洗滤可在完成20倍浓缩后进行。绘制浓缩和洗滤步骤的通量与时间关系图，可以对整个单元操作的通量进行可视化分析(图5)。在浓缩步骤结束时，通量达到40 LMH，然后在洗滤开始时略微增加到50 LMH。之后，通量在洗滤过程中缓慢下降，在工艺结束时返回到40 LMH。通量与浓度图中的断点是因为从样品容器中取样用于离线分析。整个工艺的平均工艺通量为50 LMH，完成时间为2.2小时。
为了证实浓缩和洗滤过程中的稳定性和控制性，在整个过程中对TMP和进料流道的压力降进行了监测 (图6)。进料流道的压力降测量流体通过膜包的阻力。TMP驱动流体透过膜并将较大的物质截留在膜表面。TMP和压力降在整个工艺过程中都保持相当稳定。
图5. 浓缩时，通量从90 下降到 40 LMH，在洗滤时，通量保持稳定为50 LMH。记录中的空白区间是因为从样品容器取样用于离线分析。
图6. TMP vs运行时间图表明了对抗污垢的稳健性。
非辐照和伽马辐照TFF设备的相当性
未辐照的SIUS®膜包和辐照的SIUS® Gamma装置都成功地完成了70 L料液的50倍浓缩实验，性能相当。两个工艺均在恒定TMP (10±2 psi)和CFF (7.0 L/min/m2)条件下，将70 L澄清AAV-HSC料液浓缩50 倍至 1.5 L (图7)。鉴于通量、TMP和CG的等价值和趋势，将浓缩工艺从非辐照的SIUS®膜包转移到辐照的SIUS® Gamma设备不需要调整操作参数。
图7. 非辐照 TangenX®SIUS®膜包和辐照的TangenX®SIUS® Gamma装置进行50倍浓缩时的趋势图。
SIUS® 膜包的病毒基因组和总衣壳回收率分别达到了75%和88% (图8)。SIUS® Gamma膜包的病毒基因组和总衣壳回收率值高度相当，分别为78%和> 100%。
图8. 使用SIUS® 膜包和SIUS® Gamma 装置进行浓缩时的收率比较。
讨论和总结
超滤/洗滤是AAV颗粒(如AAV- HSC)生产过程中的一个关键单元操作，利用新技术可以优化生产效率。本研究评估了封闭式SIUS® Gamma装置，目的是通过预构建的SIUS®一次性使用膜的效率，降低产品、环境和操作人员的风险。研究范围包括使用100 kD和300 kD的膜进行MWCO筛选研究，通过通量测试实验进行工艺优化以及0.1 L - 70 L的规模放大实验。
对100 kD L-筛网、300 kD L-筛网和300 kD J-筛网 HyStream配置进行的筛选实验显示，100 kD L-筛网设备是最合适的选择，可以获得50 LMH的平均恒定通量，且污染极低。
通量测试实验确定了最佳条件为TMP 15 - 20 psi、CFF 7.0 LPM/m2，在此条件下，可获得100 - 120 LMH的通量，且凝胶层形成最低。使用0.1 m2的过滤器将这些条件简单地规模放大到10 L，同时保持40 - 50 LMH的通量，且可稳健防止膜污染。
使用SIUS®膜包将浓缩和洗滤成功规模放大至10 L，并重复进行了70 L浓缩20倍的测试，以直接比较SIUS®膜包和SIUS® Gamma 装置。结果显示，通量、TMP和时间、以及回收率相当，说明辐照并不影响膜性能。用于定量分析病毒基因组拷贝数的ddPCR方法证实SIUS® 膜包和SIUS® Gamma 装置的性能非常一致，结果在75 - 80%之间。使用ELISA方法定量检测了病毒衣壳蛋白浓度，虽然结果显示差异相对较大，但两种SIUS® 形式的结果仍均大于75%。ELISA方法通常有较大的差异性，特别是对较大且更复杂的分析物，如病毒，因此得出结论，SIUS®膜包和SIUS® Gamma装置运行的收率约为75 - 85%。
由于供应商的限制，使用封闭式系统会有一定的挑战。一些供应商要求购买过滤膜包时需购买完整的流路。而其它一些供应商已经开发了专有的接头，这些接头可能运行良好，但如果使用了多种接头类型，可能会使操作相当复杂化。SIUS® Gamma 装置是第一款封闭式、伽马辐照而同时保持连接方式”开放”的TFF产品。使用非专有的接头将流路与封闭式SIUS® Gamma装置模块化整合，提供了将一次性使用的工艺效率、降低的污染风险以及系统设计的灵活性相结合的前所未有的优势。
图9. TangenX® SIUS® Gamma装置与SIUS® 膜包的相当性。平均通量、工艺时间、TMP和产物回收率等工艺参数在使用SIUS®和SIUS® Gamma装置的批处理中具有高度可比性。
综上所述，封闭式和辐照技术在生物治疗药物生产向规模可灵活调节的多产品工厂发展的趋势中扮演着重要的角色，且同时保持严格的质量标准。TangenX® SIUS® Gamma装置在AAV病毒载体生产中的通量、TMP可放大性以及回收率方面与SIUS® 一次性使用TFF膜包具有相当的性能 (图9)。除了性能之外，它的连接选择在物流中起到至关重要的作用。简单的三个连接与极低的污染风险，有助于显著降低整体污染风险。使用封闭式和辐照的设备确实会增加每批次运行的成本，但是这些成本需要与偏差降低、整体设施利用率以及可进行多产品生产所节省的成本进行权衡。成本-收益和风险评估应根据每个小组、他们的工厂以及业务目标进行针对性的评估。
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